Methoden

Medizin 1

Direktor:
Prof. Dr. med. Markus F. Neurath

Arbeitsgruppe Mukosale Immunregulation und Intestinale Zellbiologie (Prof. Dr. rer. nat. Christoph Becker)

Methodische Schwerpunkte unserer Arbeitsgruppe

Gemeinsames Forschen mit anderen Arbeitsgruppen an einer gemeinsamen Fragestellung ist besonders spannend. Kooperationsanfragen stehen wir daher stets offen gegenüber.

Wir verfügen über langjährige Erfahrung bei der Untersuchung des Darms mit molekularbiologischen, zellbiologischen und immunologischen Techniken. Ein methodischer Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe ist die Durchführung und Auswertung experimenteller Krankheitsmodelle für Entzündung, Infektion und Krebsentstehung im Darm. Darüber hinaus haben wir große Erfahrung in der Durchführung endoskopischer Techniken in präklinischen Modellen, bei der konditionalen Mutagenese des Darms im Cre-Lox-System (Villin-Cre, Villin-CreERT2) und bei der Generierung und Untersuchung von Darmorganoiden in vitro.

In vitro Kultur von Darmorganoiden aus intestinalen Stammzellen und Krypten

Untersuchungen am Darmepithel bringen viele Herausforderungen mit sich. Epithelzellen konnten bisher nach Isolation aus der Darmschleimhaut kaum oder gar nicht in vitro kultiviert werden, da die Zellen auf komplexe Interaktionen mit ihrer natürlichen Umgebung und auf Signale von Nachbarzellen angewiesen sind. In-vitro-Modelle des Darmepithels, wie zum Beispiel Monolayerkulturen mit immortalisierten Zelllinien können zwar helfen die Wirkung einzelner Variablen auf Darmzellen zu untersuchen. Sie können jedoch die Komplexität und zelluläre Vielfältigkeit des Darmepithels nicht abbilden. Hinzu kommt, dass die Immortalisierung dieser Zellinien zu funktionell signifikanten genetischen Veränderungen führt, so dass diese Zellen eine andere Physiologie als die Epithelzellen im Darm haben.  In vivo Modelle wiederum sind teilweise schwierig zu interpretieren, da experimentelle Beobachtungen nicht unmittelbar auf das Darmepithel bezogen werden können.

In den vergangenen Jahren konnte in unserem Labor die 2009 von Sato et al. beschriebe Methode zur Generierung von primären Darmorganoiden etabliert werden und neue experimentelle Anwendungen entwickelt werden. Darmorganoide haben sich in den vergangenen Jahren weltweit als wertvolles Forschungsinstrument mit hoher physiologischer Relevanz für die Darmforschung erwiesen.

Organoide, sog. "Mini-guts", sind dreidimensionale Strukturen speziell kultivierter Darmepithelzellen, die viele der wichtigsten Eigenschaften des Darmepithel abbilden. So haben sie wie dere Darm im lebenden Organismus eine Krypten-Villus Struktur, die ein zentrales Lumen umgibt. Ein entscheidender Vorteil gegenüber anderen Methoden ist vielmehr, dass Darmorganoide alle bekannten Zelltypen des adulten intestinalen Epithels beinhalten.

Organoide entstehen, wenn die in Darmkrypten enthaltene Darm-Stammzellen (LGR5+ Zellen) in einem speziellen Medium, das die intestinale Stammzellnische simuliert, kultiviert werden. Die Stammzellen beginnen zu proliferieren und das Organoid beginnt zu wachsen. Nachkommen dieser Zellen verlassen den Stammzellbereich am Kryptenboden und wandern zum Lumen des Organoids. Währenddessen differenzieren die Zellen in alle wichtigen Zelltypen des Darmepithels: Panethzellen, Becherzellen, enteroendokrinen Zellen und Enterozyten. Die Zellen ordnen sich dabei in eine Krypten-Villus Struktur rund um ein zentrales Lumen an. Aufgrund der langfristigen selbst erneuernde Potential der Stammzellen können diese "Mini-gut"-Strukturen mechanisch dissoziiert und auf unbestimmte Zeit subkultiviert werden.

Darmorganoide werden derzeit in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt. Anwendungen dieser Methode reichen von der Erforschung adulten Stammzellen über Tissue Engineering mit dem Ziel späterer Transplantation und in die Darmkrebsforschung. Das Modell wurde von unserer Arbeitsgruppe verwendet, um Wachstums- und Differenzierungsprozesse in primären Zellen zu charakterisieren. Zellen dieser Organoide können z.B. durch Transfektion manipuliert werden. Organoide eignen sich zudem als Testmodell für pharmazeutische Wirkstoffkandidaten. In unserem Labor werden Darmorganoide aus Dünn - und Dickdarmgewebe gezüchtet.

 
 
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Zusammenfassung